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    研域詳述:原代細胞復蘇和傳代流程

    發布時間: 2019-08-13  點擊次數: 1760次

    一、實驗前準備工作:
     
    1、培育瓶的包被:包被液如多聚賴氨酸或纖維粘連蛋白,以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培育瓶。37度孵箱1小時或4度過夜,從包被好的培育瓶中收回多聚賴氨酸,并用無菌水洗刷培育瓶2遍。包被好的培育瓶不要放置超過24小時,其中的包被液可吸出重復使用2-3次,留意不要污染。


    2、*培育基的配置:以內皮細胞培育基為例,把配套的胎牛血清、生長因子和雙抗參加根底培育液中。重新貼好標簽,并混勻培育基。

    二、原代細胞復蘇辦法:

    1、從液氮中取出原代細胞冷凍管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其間能夠悄悄滾動細胞,加速消融速度,大約需求1分鐘時刻。

    2、5分鐘內用培育基稀釋至原體積的10倍以上,參加培育瓶中,再用1ml培育基洗刷細胞凍存管,確保細胞都被參加培育瓶中,靜置于孵箱,12-16小時后替換培育基(除去DMSO)。今后每2天換一次液,確保細胞狀況杰出。

    三、原代細胞傳dai辦法:酶消化法

    當細胞生長至70-80%左右能夠傳代,傳代份額以1:2或1:3為佳。具體辦法如下:

    1、棄去培育瓶中培育基,用PBS洗刷培育瓶2遍,參加0.25%的胰酶消化液,以消化液能覆蓋整個瓶底為準。37度孵育4分鐘左右,輕拍培育瓶旁邊面,顯微鏡下觀察細胞消化狀況,直到80%細胞呈現圓形。

    2、細胞消化好后,參加胰酶中和液,并悄悄搖擺培育瓶,形成細胞懸液,然后將細胞和培育基轉移至離心管中,1000rpm離心5分鐘。
     
    3、棄去上清液,以1-2ml新鮮培育基重新懸浮細胞并吹打均勻,接種于包被好的新培育瓶中,瓶中已有10ml左右的培育基,放入培育箱中培育,每2天替換培育基。

     

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