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    PCR實驗出現凝膠涂布貨片狀條帶彌散的原因

    發布時間: 2023-06-13  點擊次數: 4852次

    PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR),一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的大特點,是能將微量的DNA大幅增加。PCR的原理:PCR的基本過程類似于DNA的天然復制,特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構成。

    PCR實驗中擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下:

    (1)酶量過高。減少酶量;酶的質量差,調換另一來源的酶。

    (2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

    (3)MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。

    (4)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。

    (5)引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

    (6)循環次數過多;增加模板量減少循環次數至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環。

    (7)退火溫度過低。

    (8)電泳體系有問題:

    ①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;

    ②凝膠沒有凝固好;

    ③瓊脂糖質量差。

    (9)若為PCR試劑盒則可能:

    ①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;

    ②試劑盒本身質量有問題,如引物選擇、循環參數等選擇不當。

    (10)降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

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