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    蛋白質結構解析的方法

    發布時間: 2010-03-29  點擊次數: 2774次

     

       到目前為止,蛋白質結構解析的方法主要是兩種,x射線衍射和NMR。近年來還出現了一種新的方法,叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產生的更早,也更加的成熟,解析的數量也更多,我們知道,*個解析的蛋白的結構,就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發展起來的。這兩種方法各有優點和缺點。

       這兩種方法的一般的步驟和各自的優點和缺點。電子顯微鏡(electron microscopy)作為一種新型的技術,目前的應用還是非常少,并且比較狹窄,我可能等到zui后在給它作些介紹,而且相信絕大多數人也沒有聽說過,也不會有很大的興趣。

    1.首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質的晶體。
       通常,都是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中,然后在大腸桿菌中誘導表達,提純之后摸索結晶條件,等拿到晶體之后,工作便完成的80%,將晶體進行x射線衍射,收集衍射圖譜,通過一系列的計算,很快就能得到蛋白質的原子結構。
    用x射線的優點是:速度快,通常只要拿到晶體,甚至當天就能得到結構,另外不受大小限制,無論是多大的蛋白,或者復合體,無論是蛋白質還是RNA、DNA,還是結合了什么小分子,只要能夠結晶就能夠得到其原子結構。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件。這個時候運氣就顯的特別重要。關于這個有好多有趣的離子。據說國外一個同學在摸索兩個月無果之后,毅然去度假,就將蛋白扔在一個很隨便的地方,等度假回來之后,卻發現已經結晶了。

    2.NMR(nuclear magnetic resonance)現象早已發現了很久,然后將這種方法用來解析蛋白結構,卻是近一二十年的事情。不過到今天為止,用nmr方法來解析結構已經十非常成熟的方法。
    原理暫且放在一邊,先說常規步驟。
    首先通過基因工程的方法,表達出目的蛋白,提純之后,摸索一下蛋白穩定的條件,如果蛋白沒有聚合,而且折疊良好,便將蛋白樣品(通常是1mM-3mM,500ul,Ph6-7的PBS)裝入核磁管中,放入核磁譜儀中,然后用一系列寫好的程序控制譜儀,發出一系列的電磁波,激發蛋白中的H、N13、C13原子,等電磁波發射完畢,在收集受激發的原子所放出的“能量”,其實也是小磁場,通過收集數據、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結構。
    它的優點就是,蛋白在液體中得到結構,是一個動態的結構,事實上所有在pdb中或者文獻中發表的NMR結構都是十個或者二十個結構的ensemble(集合),這就是因為這些結構都是進行能量優化后符合條件的結構,或者說就是溶液中的蛋白結構。因為是動態就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。缺點是,受大小的限制,到目前為止NMR解析蛋白結構的上限是50kd。

       無論是晶體還是NMR,蛋白都要符合下面的條件:首先表達量要大,象NMR要求1個mM500UL,這就要求十幾個毫克,結晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質中表達才行。其次,蛋白要折疊。我們知道許多蛋白,尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在,這種情況下是不行的,除非復性。如果你的蛋白在胞質中表達,如果你不確定是不是表達,可以從分子篩上的位置,或者掃CD確定一下,當然zui簡單的是做一個NMR一維譜,只需要幾分鐘。
    小于20Kd的蛋白可以考慮NMR,因為NMR研究功能核相互作用方面是更加擅長的,而且不需要結晶,現在速度也不慢。如果比較大,可以考慮晶體解析。

       對于用NMR來解析結構,zui重要的條件就是非常昂貴的核磁譜儀,以及同位素標記蛋白。只要采集了譜之后就算的得到了原始數據,其他的在電腦上通過專業的軟件處理就可以了。對于小分子蛋白不需要同位素標記,也不需要600、800MHz的譜儀,一般的400、500MHz的小型譜儀也可以做了,但是對于10K以上的蛋白,基本上就要用磁場更強的600、800Mhz的核磁譜儀。

     

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