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    免疫堿性磷酸酶組織化學技術

    發布時間: 2011-11-22  點擊次數: 2193次

    免疫堿性磷酸酶組織化學技術

    免疫堿性磷酸酶組織化學技術是以堿性磷酸酶(AKP或AP)取代HRP來顯示結果的免疫酶組織化學技術。zui早出現的是間接免疫堿性磷酸酶法(1AP),1983年Mason及Moir等建立了堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)復合物法。隨后,人們建立了更為敏感的生物素—親和素—堿性磷酸酶復合物(ABC-AP)法、S-P堿性磷酸酶法、EnVision堿性磷酸酶法以及用于原位雜交檢測的抗地高辛(Dig)、抗生物素(biotin)和抗熒光素(FITC)—AKP檢測系統。因免疫堿性磷酸酶技術具有*優點,如敏感的酶底物顯色系統、染色背景低,故應用日益廣泛,尤其在原位雜交、TUNEL等的檢測。
     


    一、間接免疫堿性磷酸酶法
    此方法的基本原理與HRP-抗體間接法類似,體,將其制備成酶標記抗體。其染色步驟如下。
    (1)切片脫蠟至水,PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP標記第
    (2)蛋白酶消化或AR(組織抗原的暴露或抗原的修復,此步視情況而定)。
    (3)滴加正常血清,阻斷20min(減少非特異性背景染色),吸去多余血清。
    (4)滴加適當稀釋的特異性一抗,37℃孵育30~60min或4℃過夜,PBS洗3min×3次。
    (5)適當稀釋的AKP標記的二抗37℃孵育30~60min,PBS洗3min×3次。
    (6)加入0.02mol/L(pH9.0)TBS(內含lmmol/L左旋咪唑,5mmol/L MgClz)阻
    斷內源性堿性磷酸酶。
    (7)切片上滴加50—100~1底物溶液(BCIP/NBT),室溫中濕盒內避光顯色30min一48h,顯色30min后鏡下觀察,待陽性充分顯示后水洗終止反應。
    (8)充分水洗后用核固紅復染5min,沖洗后系列乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片。
    (9)結果觀察,背景呈紅色,陽性產物呈紫藍色。
    注:染色結果可根據不同的顯色底物而顯示不同顏色,如用堅固紅(FR/AS-MX)產生的底物為玫瑰紅色,用堅固藍(FB/AS-MX)則產物為紫綠色,而BCIP/NBT為紫藍色。特別要強調的是,FR/AS-MX和FB/AS-MX底物系統產生的顏色反應產物,能溶于有劑溶,如乙醇、二甲苯,所以不能用樹膠封片。

    二、APAAP法
    APAAP法的原理與PAP法類似(見圖4—12),都屬于未標記抗體橋聯法,所不同的是用AKP取代了HRP。該方法較IAP法敏感性高,特別是用于標記固定過的組織,其染色步驟如下。
    (1)~(4)步同IAP法。
    (5)適當稀釋橋抗體(二抗),37~C溫育30min或室溫中孵育60min。
    (6)PBS洗3minX 3次。
    (7)適當稀釋APAAP復合物(與特異性一抗同屬),37℃溫育30min或室溫中孵育60min。
    (8)PBS洗3minx 3次。
    (9)底物顯色及復染、封片同IAP法。
    注:特異性一抗和APAAP復合物中IgG必須來源于同一種屬動物,*抗體的稀釋度要較IAP法高(濃度低)。
    APAAP法的主要優點是非特異性背景染色較淺,因為其不受內源性過氧化物酶的干擾,PAAP復合物所用的AKP是從小牛腸組織中提取,只存在于腸組織。同時,反應底物溶液的左旋咪唑具有抑制非腸源性堿性磷酸酶活性的作用,且不影響APAAP復合物中腸源性KP的活性。因此,在檢測那些富含內源性過氧化物酶的組織、冰凍切片及造血組織標本時,PAAP法是一種很好的方法。
    免疫堿性磷酸酶組織化學技術
     

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